Tác dụng của Fucoidan Mozuku đối với chấn thương mô sụn thực nghiệm

Thực nghiệm tác dụng của fucoidan, một polysaccharide sulfat hóa, trong việc tăng tốc chữa lành vết thương sụn thử nghiệm trên mô hình thỏ. Một mô hình sụn bị thương được tạo ra bằng cách phẫu thuật bằng cách đưa vào ba lỗ, một trong sụn khớp của xương chày giữa và hai trong sụn chêm của xương đùi xa.

Thỏ ở ba nhóm thí nghiệm (nhóm F) được sử dụng Fucoidan có bảy trọng lượng phân tử khác nhau (8, 50, 146, 239, 330, 400 hoặc 1000 kD) trong 3 tuần bằng cách sàng lọc. Những con thỏ đối chứng (nhóm C) được cung cấp nước ad libitum.

Tảo Mozuku được sử dụng rộng rãi tại Nhật Bản

Sau thời gian thực nghiệm, kiểm tra vĩ mô cho thấy mức độ lấp đầy của nhóm Fucoidan cao hơn nhóm C. Về mặt mô học, các lỗ được lấp đầy bởi sợi collagen và nguyên bào sợi ở nhóm C, và bởi nguyên bào sợi và nguyên bào sợi ở nhóm F. Phân tích hình ảnh của các mẫu xét nghiệm nhóm F nhuộm màu xanh lam Alcian và safranin O cho thấy tăng sản xuất glycosaminoglycans (GAGs) và proteoglycan (PGs), tương ứng. Một số lỗ bị thương đã được sửa chữa tốt cả về mặt vĩ mô và kính hiển vi và được lấp đầy bởi các mô sụn; chất nền sụn như PGs và GAGs được tạo ra ở các nhóm F 50, F 146 và F 239. Do đó, việc sử dụng Fucoidan giúp tăng cường chữa lành vết thương sụn về mặt hình thái.

1. Điều chế Fucoidan

Các loại Fucoidan có trọng lượng phân tử trung bình khác nhau (330, 400 và 1000 KD) được chiết xuất từ ​​Okinawa mozuku bằng nước nóng. Các fucoidan được chiết xuất (trọng lượng phân tử: 330 KD) được tiếp tục xử lý trong điều kiện thủy nhiệt để chuyển đổi thành các fucan có trọng lượng phân tử thấp (8, 50, 146 và 239 KD). Fucoidan có bảy trọng lượng phân tử khác nhau được sử dụng cho thí nghiệm.

2. Động vật

Một mô hình sụn bị thương được thực hiện theo cách tương tự như báo cáo trước đây của chúng tôi [1]. 24 con thỏ khỏe mạnh về mặt lâm sàng (con cái bị bạch tạng Nhật Bản; tuổi trung bình, 12 tuần) với trọng lượng cơ thể từ 2,0–2,5kg đã được sử dụng. Các con vật được sử dụng trong thí nghiệm sau 1 tuần làm quen với môi trường phòng thí nghiệm. Tất cả các quy trình thử nghiệm đã được phê duyệt bởi các ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Đại học Tottori và được tiến hành theo các nguyên tắc hướng dẫn của Hiệp hội Sinh lý Hoa Kỳ về việc chăm sóc và sử dụng động vật.

3. Fucoidan

Những con thỏ thí nghiệm được chia thành tám nhóm ( n = 3), cụ thể là nhóm đối chứng (nhóm C), nhóm nhận 8 KD fucoidan (nhóm F 8), nhóm nhận 50 KD fucoidan (nhóm F 50), nhóm nhận 146 KD fucoidan (nhóm F 146), nhóm nhận 239 KD fucoidan (nhóm F 239), nhóm nhận 330 KD fucoidan (nhóm F 330), nhóm nhận 400 KD fucoidan (nhóm F 400) và nhóm nhận 1000 KD fucoidan (nhóm F 1000). Các nhóm Fucoidan được sử dụng dung dịch fucoidan hòa tan trong nước máy với tỷ lệ 1g/con/ngày trong ba tuần.

Bột Fucoidan sau điều chế

4. Chuẩn bị mô hình chấn thương sụn khớp

Thuốc giảm đau (xylazine hydrochloride, 10 mg/kg) đã được sử dụng như thuốc tiền mê. Sau khi gây mê, khởi mê được thực hiện trong một hộp với hỗn hợp 5% isoflurane trong oxy. Gây mê được duy trì bằng cách hít hỗn hợp 3% isoflurane trong oxy bằng mặt nạ. Lông ở khớp gối trái được cắt và khử trùng khu vực này bằng dung dịch chlorhexidine (Hibiscrub, Zeneka, Osaka) và cồn 70%.

Tiếp cận từ phần bên của khớp gối, một vết rạch được thực hiện theo chiều dọc trên da từ phần trung tâm của xương đùi về phía ống chày. Bao khớp bị rạch, và xương bánh chè của khớp cứng lộ ra hoàn toàn bằng cách làm trật khớp xương bánh chè về phía giữa một cách giả tạo. Ba lỗ có đường kính 2 mm và sâu 4 mm được tạo bằng máy khoan cầm tay (Động cơ siêu nhỏ D-2, Osada Medical, Tokyo) tại sụn khớp của xương đùi giữa (một lỗ) và ống xương đùi (hai lỗ) của xương đùi xa.

Sau đó, vết thương được rửa sạch bằng dung dịch nước muối và khâu bao khớp và đóng lại bằng chỉ thấm tổng hợp (3-0 PDSII, Johnson & Johnson, Tokyo). Các mô dưới da và da được khâu bằng nylon (USP 3-0 s khâu, Suprylon, Vomel, Đức).

Trong thời gian 1 tuần sau khi phẫu thuật, bề mặt vết thương được khử trùng bằng povidone-iodine (Isodine, bánh kẹo Meiji, Tokyo) mỗi ngày một lần, và 10mg/kg oxytetracycline (Terramycin, Pfizer, Tokyo) được tiêm dưới da hai lần một ngày để ngăn ngừa nhiễm trùng.

5. Đánh giá việc chữa lành tại các địa điểm bị thương

Đối với các phát hiện vĩ mô, tỷ lệ phục hồi các lỗ khuyết tật được cho điểm theo báo cáo trước đó của chúng tôi [2]: sửa chữa dưới 50% độ sâu khuyết tật, điểm 0; sửa chữa độ sâu khuyết tật dưới 60%, điểm 1; sửa chữa độ sâu khuyết điểm dưới 80%, điểm 2; và hơn 80% sửa chữa độ sâu khuyết tật, điểm 3.

6. Kiểm tra mô học

Xương đùi trái phục hồi được cố định trong dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10%. Sau khi cố định, khớp nối đã vận hành được cắt thành độ dày 5mm và được tráng men trong 1 ngày bằng cách lắc trong dung dịch axit formic 5%. Sau khi bị vôi hóa, mô được ngâm để trung hòa trong dung dịch natri sulfat 5% trong 1 ngày, và sau đó được rửa trong khoảng 10 giờ dưới vòi nước.

Sau khi sử dụng phương pháp nhúng parafin thông thường, mô được cắt bằng microtome thành các đoạn 5 μm. Quá trình nhuộm được thực hiện bằng phương pháp nhuộm kép hematoxylin/eosin; Các vết màu xanh safranin O và Alcian được sử dụng để nhuộm PGs và GAG, tương ứng.

Chúng tôi ghi lại sự khác biệt giữa các chất được phục hồi tại các bộ phận bị thương trong tất cả các nhóm bằng kính hiển vi (BX51-FL, Olympus, Tokyo). Hình ảnh phóng đại 200 × của các bộ phận được khôi phục, sụn khớp và vùng phát triển bị nhuộm bởi các vết safranin và vết xanh Alcian được chụp bằng máy tính sử dụng Photograb ab-300 phiên bản 1.0 (phần mềm Macintosh, Fujifilm, Tokyo) và các hình ảnh được số hóa bằng Adobe Photoshop 3.0 (phần mềm Macintosh, Adobe System , Tokyo).

Trong các vết bẩn safranin, các pixel màu đỏ biểu thị PG được tính để không bao gồm các pixel màu không cụ thể. Trong các vết màu xanh Alcian, các pixel màu chàm biểu thị GAG cũng được tính. Tỷ lệ của mỗi pixel màu trong tổng số 120.000 pixel tính theo màu sắc quan sát được (lấy mẫu ngẫu nhiên 20.000 pixel tại 6 vị trí) sau đó được tính toán thông qua kỹ thuật xử lý ảnh. 0 (phần mềm Macintosh, Fujifilm, Tokyo) và các hình ảnh được số hóa bằng Adobe Photoshop 3.0 (phần mềm Macintosh, Adobe System, Tokyo).

Tỷ lệ của mỗi điểm ảnh màu trong tổng số 120.000 điểm ảnh chiếm màu sắc quan sát được (lấy mẫu ngẫu nhiên 20.000 điểm ảnh tại 6 vị trí) sau đó được tính toán thông qua kỹ thuật xử lý ảnh, các pixel màu chàm biểu thị GAG cũng được tính.

---------------------

[1] Metsaranta M., Kujala UM, Pelliniemi L., Osterman H., Aho H., Vuorio E. Bằng chứng cho thấy không đủ biệt hóa chondrocytic trong quá trình sửa chữa các khuyết tật toàn bộ bề dày của sụn khớp. Ma trận Biol. Năm 1996; 15 : 39–47. doi: 10.1016 / S0945-053X (96) 90125-0.

[2] Hashida M., Miyatake K., Okamoto Y., Fujita K., Matsumoto T., Morimatsu F., Sakamoto K., Minami S. Tác dụng hiệp đồng của d -glucosamine và collagen peptide trong việc chữa lành chấn thương sụn thực nghiệm. Macromol. Biosci. Năm 2003; 3 : 596–603. doi: 10.1002 / mabi.200350025.